Wojciecha Bieżanowskiego, który został tu pierwszym proboszczem (1582-1616).
Czynnie urządzeniem kościoła i parafii ostrogskiej zajął się jej drugi proboszcz, ks. Wojciech Witkowski (1619-1623), który obok wielu walorów znał język cerkiewno-słowiański i literaturę Kościoła ruskiego oraz "miłował i zbierał księgi, uprawiał literaturę i skrzętnie gromadził wiadomości dziejowe".
26 października 1624 roku, nazajutrz po nowej erekcji Anny Alojzy Chodkiewiczowej, kościół ostrogski został uroczyście konsekrowany przez Stanisława Łubieńskiego, biskupa łuckiego. W 1702 roku kosztem miejscowego proboszcza bpa Stanisława F. Biegańskiego (1699-1709) zostało odrestaurowane probostwo, pokryty kościół i postawiona nowa dzwonnica. Jesienią 1703 roku wymurowano zaś przy kościele kruchtę z babińcem. W następnym roku sprawiono do kościoła chrzcielnicę.
26 sierpnia 1705 roku biskup Stanisław F. Biegański wyprosił u hetmana kozackiego Iwana Mazepy, idącego do Polski naprzeciw wojskom szwedzkim, uchronienie Ostroga i Luczyna.
10 lipca 1707 roku w nocy z soboty na niedzielę został poważnie okradziony kościół. Podejrzenie padło kwaterującą wówczas w Ostrogu piechotę moskiewską, sprawców nie ujęto.