Do botaniki trafił dzięki studiom medycznym, w sposób typowy dla większości naturalistów epoki Odrodzenia, tj. studiując antyczne dzieła Teofrasta, Dioskuryda czy „Historię naturalną” Pliniusza. Poznał również prace pierwszych naturalistów z Italii. Głównym dziełem Brunfelsa z zakresu botaniki jest wielki herbarz (zielnik) pt. Herbarum vivae eicones, do którego inspiracją było dla autora dzieło Dioskuryda. Wydany w trzech tomach (w 1530, 1532 i 1536 r.) w Strasburgu, zawierał opisy i ilustracje do 135 gatunków roślin. Herbarz Brunfelsa przedstawiał wyraźny postęp w stosunku do niedawnych ksiąg średniowiecznych, nie było to jednak jeszcze dzieło rewolucyjne. Z analizy tekstu wynika że Brunfels, który posiłkował się pracami powstałymi na Półwyspie Apenińskim, nie zdawał sobie np. sprawy ze zróżnicowania geograficznych zasięgów poszczególnych gatunków roślin. Wyrażał on zdziwienie brakiem w rejonie Strasburga wielu gatunków opisanych przez Dioskuryda, a dziś określanych jako śródziemnomorskie. Historycy nauki wyżej niż tekst Brunfelsa cenią ilustracje do niego, które wykonał Hans Weiditz z Bazylei, prawdopodobnie uczeń Dürera.