W 1922 r. odkrył, że w tkankach i wydzielinach ludzkiego ciała znajduje się substancja zdolna do rozpuszczania (lizy) niektórych bakterii. Ze względu na podobieństwo do enzymów nazwał ją lizozymem. Wyizolował też bakterię, która była wrażliwa na działanie lizozymu i nazwał ją Micrococcus lysodeikticus (później okazało się, że była to znana już wcześniej Micrococcus luteus), a została pobrana przez Fleminga prawdopodobnie z własnego nosa. Swoje odkrycie opisał w artykule w Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences.
W 1928 r. badał nietypowe szczepy bakterii z rodzaju Staphylococcus. W lipcu pozostawił w laboratorium płytki zaszczepione tymi bakteriami i udał się na wakacje. Po powrocie, 3 września, razem z przyjacielem i wcześniejszym współpracownikiem, Danielem Prycem przeglądał uzyskane kolonie bakterii. Na jednej z nich zauważyli zakażenie pleśnią, wokół której był obszar czysty od bakterii. Pryce zwrócił uwagę, że przypomina to sytuację, gdy Fleming odkrył lizozym i nie przywiązał większej uwagi do zaobserwowanego zjawiska, natomiast Fleming podjął dalsze badania. W 1929 r. badacz wspomniał o swoim odkryciu na łamach British Journal of Experimental Pathology. Po kilku latach długotrwałych eksperymentów odkrył penicylinę G, która działa silnie bakteriobójczo, a łagodnie dla człowieka.