Montaż pierwszego prototypu ruszył na początku 1941 r. w zakładach Messerschmitta w Neu Offing w pobliżu Ulm. Pierwotna koncepcja przewidywała zbudowanie samolotu pozbawionego uzbrojenia obronnego, ale o parametrach lotu przewyższających osiągi myśliwców. Samolot został wyposażony w powiększone zbiorniki paliwa umożliwiające mu dalekie loty. Nie posiadał hermetyzowanej kabiny załogi a silniki Jumo 211-J nie były wyposażone w sprężarki. Na Messerschmitta wywierano presję aby dostarczył Luftwaffe nowy bombowiec w jak najszybszym czasie. Ukończenie budowy pierwszego prototypu planowano na 10 października 1942 r., jednakże powodu z braku dostaw podzespołów termin ten przeciągnął się do końca roku.
Prototyp, o znakach taktycznych RE + EN i numerze zakładowym W.Nr. 26400001, został oblatany przez pilotów doświadczalnych Karla Baura i Fritza Wendela 23 grudnia 1942. Samolot latał poprawnie, jednak jego osiągi były poniżej oczekiwań, dlatego też planowano zbudowanie wersji sześciosilnikowej oznaczonej jako Me 264B (opracowywano go jako Projekt P.1075). Ponadto piloci doświadczalni informowali o problemach związanych ze sterowaniem – samolot miał źle wyważone stery, przez co wymagał dużych sił na wolancie. Komfort lotu obniżały również spaliny, przedostające się do kabiny załogi.