W 1938 roku Indiana Jones otrzymuje propozycję uczestniczenia w wyprawie zorganizowanej w celu znalezienia św. Graala. Początkowo nie chce brać udziału w poszukiwaniu chrześcijańskiej relikwii. Zmienia zdanie, gdy dowiaduje się, że jeden z członków ekspedycji już zaginął i że jest nim jego ojciec, Henry Jones (Sean Connery). Choć ojciec i syn nie widzieli się od lat, Indiana decyduje się jechać do Wenecji, gdzie znajduje się grobowiec średniowiecznego rycerza, który dotarł do cudownego kielicha. Towarzyszy mu Marcus Brody. Napotyka austriacką Doktor Elsę Schneider, która na zlecenie nazistów ma przechwycić Graala. Mami Indy’ego propozycją współpracy.
Wkrótce wszyscy troje przeszukują grobowiec. Atakują ich tajemnicze indywidua, które porywają Brody’ego i ścigają Elsę wraz z Jonesem na rzece. Po pościgu jeden z nich – Kazim – mówi Jonesowi, by nie szukał Graala. Jones i Elsa wyruszają jednak do Austrii, gdzie spotykają ojca Indy’ego i nazistów pod wodzą historyka Waltera Donovana i pułkownika Vogela. Wtedy też wychodzi na jaw, że Elsa jest ich wspólniczką. Podpaleniu ulega dom, skąd udaje się im wkrótce uwolnić.