W 1857 roku kolegium zostało ponownie zamknięte z powodu nadwyrężenia finansów szkoły i niemożności utrzymania odpowiedniej liczby personelu. Pozostawało zamknięte przez cały okres wojny secesyjnej, pełniąc funkcję szpitala wojskowego. Augustianie ponownie otwarli uczelnię we wrześniu 1865 roku i od tego czasu działa nieprzerwanie. Szkoła przygotowawcza została przeniesiona do .
Uczelnia kształciła wyłącznie młodzież męską do 1918 roku, kiedy to uruchomiono zajęcia wieczorowe przygotowujące zakonnice do nauczania w szkołach parafialnych. W 1938 roku świecka kobieta po raz pierwszy otrzymała dyplom ukończenia studiów. Po otwarciu szkoły pielęgniarstwa w 1953 roku, kobiety zaczęły kształcić się również w ramach studiów stacjonarnych. Pierwsza studentka rozpoczęła studia inżynierskie w 1958 roku. Uczelnia stała się w pełni koedukacyjną w 1968 roku.
Podczas II wojny światowej Villanova była jedną ze 131 amerykańskich szkół wyższych bioracych udział w programie specjalnego szkolenia zawodowego United States Navy oferującego studentom możliwość uzyskania stopnia oficerskiego marynarki wojennej (). Od tamtej pory Uniwersytet Villanova wykształcił 25 admirałów i generałów.