W 1592 roku przeniósł się na Uniwersytet w Padwie, gdzie do roku 1610 wykładał geometrię, mechanikę i astronomię. Podczas pobytu w Padwie Galileusz dokonał istotnych odkryć z zakresu nauk ścisłych i stosowanych (badania ruchu, konstrukcja teleskopów).
Nigdy się nie ożenił, ale miał z troje dzieci: córki Virginię (ur. 1600) i Livię (ur. 1601), które zostały zakonnicami, a także syna (ur. 1606).
Galileusz a Kościół katolicki Stosunki z Kościołem przed procesem thumb|Rysunki tarczy Księżyca z zaznaczonymi górami i kraterami w dziele Galileusza (faksymile) Sidereus Nuncius (1610) Na początku 1610 roku Galileusz opublikował swoje dzieło , gdzie opisuje swoje odkrycia: Dostrzegł góry na Księżycu oraz odkrył (co przeczy teorii geocentrycznej, a potwierdza heliocentryczną) fazy Wenus i księżyce Jowisza. Informacja ta dotarła do zakonu jezuitów. 10 grudnia 1610 roku jeden z największych matematyków tamtej epoki, jezuita Christopher Clavius napisał do Galileusza, że jezuiccy obserwatorzy nieba potwierdzili jego odkrycia, dlatego zaczął go namawiać do odwiedzenia Rzymu.