Pierwszy lot odbył się 17 grudnia 1935, w 32. rocznicę pierwszego lotu braci Wright. Rozkładowe loty DST zostały zainaugurowane 18 września 1936. Samolot okazał się sukcesem komercyjnym. Opinia kierownictwa American Airlines głosiła, że jest to pierwszy samolot zarabiający pieniądze na przewozie pasażerów, bez dotacji rządowych.
Podczas II wojny światowej wiele cywilnych DC-3 zostało wcielonych do wojskowych sił powietrznych. Produkowano też w dużych liczbach wersje wojskowe – C-47, R-4D i Dakota. Całkowita produkcja, łącznie z licencyjnymi Lisunowami Li-2 w ZSRR i Showa L2D w Japonii, wyniosła co najmniej 17.276 egzemplarzy.
Po wojnie duża liczba DC-3 została wycofana ze służby w lotnictwie wojskowym i trafiła do sprzedaży. Niska cena w połączeniu z prostą i ekonomiczną eksploatacją sprawiły, że samoloty te stały się podstawą flot linii lotniczych na całym świecie. Wprowadzony do sprzedaży kolejny model Super DC-3 nie sprzedawał się dobrze, ze względu na dużą konkurencję ze strony tańszych samolotów używanych, dostępnych na rynku. Samoloty te były na wyposażeniu większości linii lotniczych na świecie, w tym w PLL LOT.