W 1610 roku miała miejsce kanonizacja św. Karola Boromeusza, która stała się inspiracją do budowy nowego większego kościoła na północny wschód od starego. W 1612 roku nabyto i oczyszczono teren przy Corso. Kamień węgielny został położony 29 stycznia 1612 roku, prace nadzorował Onorio Longhi (sugerowano również, że autorem projektu kościoła był jego ojciec Martino Longhi starszy). Nowy kościół został dedykowany Świętym Ambrożemu i Karolowi Boromeuszowi. Z powodu trudności finansowych budowa trwała wiele lat. Onorio Longhi zmarł przed ukończeniem prac w nawie głównej, w związku z tym wnętrze zaprojektował jego syn Martino Longhi młodszy w 1642 roku, projekt ten nieco zmienił Pietro da Cortona w 1651 roku, który również wzniósł kopułę i apsydę w 1668 roku. Fasada została ostatecznie ukończona w 1684 roku przez Giana Battistę Menicucciego i Maria da Canepinę.
Papież Pius XI 21 grudnia 1929 roku nadał kościołowi godność bazyliki mniejszej.
Architektura i sztuka Bazylika jest trójnawowa z transeptem, nawy boczne mają po trzy boczne kaplice. Na skrzyżowaniu nawy głównej z transeptem umieszczono kopułę położoną na ośmiobocznym bębnie. Półkoliste kopuły znajdują się również na dachach kaplic bocznych.