350px|thumb|Etapy klonowania genu
Klonowanie DNA, klonowanie molekularne, klonowanie genów – metody stosowane w biologii molekularnej, za pomocą których fragmenty cząsteczki DNA (zwykle geny) są przenoszone do organizmu biorcy i powielane w nim.
W wyniku klonowania DNA uzyskuje się komórki transformowane genetycznie. Transformacja ta może nie mieć wpływu na fenotyp i służyć do uzyskania wielu kopii cząsteczki DNA. Może również prowadzić do ekspresji wprowadzonych genów w komórkach gospodarza i uzyskania kodowanych przez nie białek.
Techniki rekombinowania i klonowania DNA stanowią najważniejszy aspekt inżynierii genetycznej obejmujący wycinanie, modyfikowanie i łączenie cząsteczek DNA in vitro oraz namnażanie rekombinowanego DNA w układzie wektor/gospodarz. Pozwala to na uzyskiwanie nowych kombinacji genów i tworzenie organizmów genetycznie modyfikowanych.
Do głównych etapów klonowania DNA należy na ogół: otrzymywanie fragmentu DNA zawierającego pożądany gen; łączenie pozyskanych fragmentów z cząsteczkami wektorowymi; wprowadzanie zrekombinowanych wektorów do komórek, w których mogą się powielać; identyfikacja i selekcja organizmów z pożądaną sekwencją.
Do klonowania stosuje się zwykle: geny otrzymane z fragmentów DNA wyciętych za pomocą enzymów restrykcyjnych; geny zsyntetyzowane na matrycach mRNA, które poprzez odwrotną transkrypcję przepisywane są na komplementarną sekwencję cDNA. Następnie RNA trawi się rybonukleazą H, a do pojedynczej nici DNA dosyntetyzowuje się drugą przy udziale polimerazy DNA I. Tak pozyskany DNA można łączyć z wektorem; geny otrzymane w wyniku syntezy chemicznej. Dotyczy to stosunkowo niewielkich białek, o krótkich genach, które syntetyzuje się na podstawie składu aminokwasowego, wprowadzając do mieszaniny reakcyjnej nukleotydy w ściśle określonej kolejności.
Rys historyczny Techniki rekombinowania i klonowania DNA zostały opracowane w latach 70. XX w., umożliwiając rozwój inżynierii genetycznej. Rozwój umożliwiło odkrycie przez Hamiltona Smitha i współpracowników, że endonukleazy restrykcyjne mogą przecinać DNA w miejscu o specyficznej sekwencji. We wczesnych latach 70. erę technologii rekombinowanego DNA zapoczątkowali Herbert Boyer, Stanley Cohen i Paul Berg. Pierwszą rekombinowaną cząsteczkę DNA uzyskano na Uniwersytecie Standforda w 1972, stosując enzymy restrykcyjne jako „nożyczki” i ligazę DNA jako „klej”. Pierwszy gen eukariotyczny sklonowano w 1974.
Enzymy restrykcyjne i ligaza DNA thumb|250px|Przykładowy enzym restrykcyjny BamHI rozpoznaje sekwencję 5'-GGATCC-3' w DNA i przecina jego obie nici po pierwszej guaninie od końca 5', pozostawiając lepkie końce
W technikach inżynierii genetycznej szeroko stosuje się endonukleazy restrykcyjne klasy II, które przecinają cząsteczkę DNA dokładnie w rozpoznawanym miejscu. Są one narzędziem fragmentowania DNA przez cięcie w określonych miejscach, co umożliwia izolację genów lub zespołów genów. W większości przypadków enzymy te przecinają obie nici cząsteczki DNA na różnej wysokości, przez co powstają tzw. lepkie końce. Dzięki temu ułatwione jest łączenie fragmentów. Fragmenty DNA różnego pochodzenia przecięte tym samym enzymem restrykcyjnym po umieszczeniu razem w odpowiednich warunkach mogą połączyć się wiązaniami wodorowymi między parami komplementarnych zasad azotowych w lepkich końcach. Aby powstały jeszcze kowalencyjne połączenia fragmentów stosuje się ligazę DNA, najczęściej pochodzącą z bakteriofaga T4. Tworzy ona między nimi wiązania fosfodiestrowe; również tworzy wiązania w wypadku, kiedy mają „tępe końce”, choć z mniejszą wydajnością.
Podczas klonowania DNA pożądany fragment DNA z genem łączy się z cząsteczkami wektorowymi, które stanowią niewielką cząsteczkę DNA zdolną do replikacji w komórce gospodarza.
Wybór gospodarza Organizmem powszechnie używanym jako biorca materiału genetycznego jest bakteria Escherichia coli. Jest ona łatwa w namnażaniu, dobrze zbadana pod względem genetycznych mechanizmów i z powodzeniem można wprowadzić do niej wiele typów wektorów. W mniejszym stopniu używane są gatunki Bacillus, Pseudomonas i Streptomyces. Jednak dostępnych jest mniej wektorów odpowiednich dla tych komórek i wprowadzanie obcego materiału genetycznego może być czasami kłopotliwe.
E. coli należy jednak do prokariotów, organizmów nieposiadających jądra komórkowego i innych organelli, funkcjonujących w odmienny sposób od komórek eukariotycznych. W związku z tym niektóre eukariotyczne geny mogą w nich nie funkcjonować prawidłowo, a wyprodukowane przez nie białka mogą nie być w pełni funkcjonalne. Dlatego też do klonowania DNA jako gospodarza używa się również trudniejsze do eksperymentowania eukarioty, od mikroorganizmów jak drożdże czy glony aż po komórki wielokomórkowych, złożonych organizmów. Manipulacje genetyczne u roślin wyższych i zwierząt mają często na celu stworzenie organizmu transgenicznego, rzadziej w celu służenia jako bioreaktor i produkcji dużych ilości określonego białka.
Jednym z najczęściej używanych eukariotów w inżynierii genetycznej są drożdże Saccharomyces cerevisiae. Poza tym używa się także grzybów Aspergillus nidulans, Neurospora crassa. W przypadku potrzeby użycia komórek roślinnych często wykorzystuje się jednokomórkową zielenicę Chlamydomonas reinhardtii – organizm łączący zalety mikroorganizmów z roślinną strukturą i organizacją komórek. Komórki roślinne i zwierzęce do eksperymentów często rosną w postaci kultur komórkowych.
W wyniku klonowania DNA można uzyskać nie tylko transformowane komórki roślinne, ale nawet cały organizm ze zmienionym DNA, który będzie przekazywał taki zmodyfikowany DNA potomstwu, w nasionach. W warunkach in vitro jest bowiem stosunkowo łatwo odtworzyć całą roślinę z komórki, choć pewne trudności występują z tym w przypadku jednoliściennych.
Hodowla komórek zwierzęcych bywa jeszcze trudniejsza, często wymagają one stałego podłoża, ich wzrost jest znacznie wolniejszy niż w przypadku mikroorganizmów i tolerują znacznie mniejsze zagęszczenie. Ogranicza to ilość pozyskiwanego rekombinowanego białka, jednak taki gospodarz może być jedynym sposobem na uzyskanie funkcjonalnego białka. Klonowanie genów, umieszczanie ich pod kontrolą silnego promotora może zwiększać wydajność produkcji takich białek.
Jeszcze więcej trudności sprawia pozyskanie organizmu zwierzęcego, który we wszystkich komórkach zawierałby zmodyfikowany DNA. Jedną z technik używanych w przypadku takich ssaków jak myszy jest usunięcie zapłodnionego jaja z jajowodów, zastosowanie mikroiniekcji genu oraz ponowne umieszczenie transformowanych komórek w układzie rozrodczym matki. Technika ta jest jednak nieskuteczna w przypadku wielu innych ssaków i wtedy stosuje się nieco inną technikę klonowania – transferu jądra z komórki somatycznej. Mikroiniekcję pożądanego genu przeprowadza się w tym wypadku na komórce somatycznej, co jest bardziej wydajnym zabiegiem niż na zapłodnionym jaju. Następnie jej jądro jest usuwane i umieszczane w oocycie, którego własne jądro zostało usunięte. Taka komórka wszczepiana jest do macicy matki zastępczej.
Wektory
Fragmenty DNA mogą być wprowadzane do komórek za pośrednictwem wektorów zapewniających powielanie wprowadzonego genu (wektory klonujące), często również zapewniających jego wydajną ekspresję (wektory ekspresyjne). Wektor jest cząsteczką DNA. Może ona mieć formę plazmidu, faga, sztucznego chromosomu, kosmidu. Istotne jest dopasowanie wektora i organizmu gospodarza. Nie istnieją uniwersalne wektory do wszystkich rodzajów komórek. Najważniejszym elementem charakteryzującym jego specyficzność jest miejsce inicjacji replikacji ori. Jeśli ma służyć do namnażania fragmentów DNA w dwóch różnych organizmach, musi mieć odpowiednie sekwencje ori obu organizmów.
Poza tym wektory posiadają zwykle tzw. markery – geny nadające łatwo dostrzegalne cechy fenotypowe pozwalające odróżnić, które komórki przyjęły wektor, oraz które komórki przyjęły taki wektor, do którego z powodzeniem został wbudowany pożądany fragment DNA.
Zarówno wektor, jak i klonowany DNA musi zostać przecięty tym samym enzymem restrykcyjnym. Na końcach wektora i klonowanego DNA powstają wtedy jednoniciowe komplementarne zakończenia (lepkie końce). Po wymieszaniu tak przeciętych fragmentów DNA z przeciętymi wektorami w obecności ligazy DNA następuje ich łączenie. Otrzymane hybrydowe cząsteczki mogą być następne przeznaczone do wprowadzenia do komórki gospodarza. Gen pochodzący z jednego organizmu rzadko ulega ekspresji w innym organizmie. Problem ten może być jednak przezwyciężony przez użycie wektorów ekspresyjnych.
Wprowadzanie DNA do komórek Można wyróżnić dwa główne typy transformacji genetycznej zachodzącej przy klonowaniu DNA – transformację autonomiczną i transformację integracyjną. W przypadku transformacji autonomicznej wprowadzony DNA replikuje się niezależnie od genomu biorcy (np. w ramach replikacji plazmidu). Techniki klonowania wykorzystujące ten typ transformacji najczęściej stosuje się do mikroorganizmów.
W wariancie integracyjnym wprowadzony DNA wbudowywany jest w genom biorcy i replikuje się wspólnie z nim. W ten sposób najczęściej transformowane są organizmy wyższe. Wprowadzanie obcego DNA do genomu biorcy może zachodzić dzięki aktywności enzymów biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA i rekombinacji. Łączenie dwóch dowolnych końców liniowego, dwuniciowego DNA może zachodzić na zasadzie rekombinacji niehomologicznej, jednak w wyniku tego procesu wprowadzane DNA wbudowywane jest w przypadkowym miejscu w genomie. Trudniejsza jest integracja DNA w konkretne miejsce w genomie. W tym wypadku wektor musi posiadać dodatkowe sekwencje, aby umożliwić zajście rekombinacji homologicznej. Aby upewnić się, że transgen został wbudowany w genomowe DNA można zastosować metody cytogenetyki molekularnej. Częściej stosuje się jednak tańsze sposoby jak hybrydyzacja Southerna czy PCR.
Do wprowadzania DNA do komórek najczęściej używa się technik transformacji i transfekcji. W kontekście komórek E. coli transformacja odnosi się do pobierania DNA w postaci plazmidu, a transfekcja – fagowego DNA. Często jednak termin transfekcja odnosi się do pobierania dowolnego DNA przez dowolną komórkę; poza tym w zupełnie innym kontekście mówi się o transformacji nowotworowej.
Transformacja naturalna występuje u wielu bakterii. Jest ona jednak możliwa tylko w określonych warunkach, a stan, w którym możliwe jest jej zajście nazywany jest stanem kompetencji. W warunkach laboratoryjnych stosuje się metodę transformacji indukowanej, gdzie komórki inkubowane są z pożądanym DNA ok. 20–30 minut w lodowatym roztworze chlorku wapnia, a następnie poddawane są krótkiemu szokowi cieplnemu (zwykle 2 minuty w temperaturze 42 °C). Proces ten nie jest wydajny i tylko nieznaczny ułamek kompetentnych komórek ulega transformacji, dlatego ten proces bywa etapem limitującym w klonowaniu DNA. Wiele firm biotechnologicznych oferuje już gotowe szczepy kompetentnych komórek do eksperymentów, które często są bardziej wydajne w transformacji.
Poza tym można zastosować wektory oparte na genomie bakteriofaga λ. Bakteriofag ten wstrzykuje swój liniowy DNA do komórki, gdzie przekształca się on w formę kolistą. Jego DNA ulega w niej replikacji, może tworzyć potomne cząstki fagowe. Nowe fagi gotowe do infekowania nowych komórek opuszczają bakterię, zwykle powodując jej śmierć. Jest to tzw. cykl lityczny. Jednakże bakteriofag λ, w przeciwieństwie do wielu innych bakteriofagów, może wejść w tzw. cykl lizogeniczny. W tym wypadku jego genom jest włączany w chromosom bakteryjny i jest replikowany wraz z nim podczas każdego podziału komórki. W wektorach fagowych łatwiej jest klonować większe fragmenty DNA, a wydajność infekcji jest wyższa w porównaniu z wydajnością transformacji.